多巴胺β羟化酶基因多态性与儿童多动症相关性研究 45页

徐州医学院硕士学位论文多巴胺β羟化酶基因多态性与儿童儿动症相关性研究姓名：张婷申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：印晓星2012-05 徐州医学院硕士学位论文多巴胺羟化酶基因多态性及单倍体型与儿童多动症相关性研究中文摘要目的通过多巴胺B羟化酶(DBH)基因rsl611115(一1021C们，rsll08580(444G／A)，rs2519152(№I)三个多态性位点的单倍体型筛查，探索DpH与中国苏北地区汉族人群儿童注意力缺陷多动障碍(Attention-deficithyperactivitydisorder，ADHD)的关联，以揭示DBH在ADHD病因学机制中的作用。方法采用病例．对照研究，应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR_I江LP)分析技术，对入选的50例苏北地区汉族注意缺陷多动障碍患儿及50例正常儿童的rsl611115，rsll08580，rs2519152三个多态性位点基因型进行检测，利用ELISA⋯——～一法检测DBH活性。结果50例ADHD忠儿rsl611115位点CC、CT、TT型分别为37例(74．0％)、11例(22．O％)、2例(4．O％)，等位基因C和T的频率分别为85．0％和15．0％。贮检验表明样本具有群体代表性(躬=0．942，尸>0．05)。50例正常儿童rsl611115位点CC、CT、TT型分别为39例(78．0％)、10例(20．0％)、1例(2．0％)，等位基因C和T的频率分别为88．0％和12．0％。贮检验表明样本具有群体代表性(躬=O．141，P>0．05)。ADHD患儿与正常儿童DpHrsl611115位点的三种基因型比较，差异无统计学意义6，2=0．434，尸：0．805)，等位基因之间比较，差异也无统计学意义(j口=O．385，仁=O．535)。50例ADHD患儿rsll08580位点AA、AG、GG型分别为37例(74．O％)、10例(20．O％)、3例(6．0％)，等位基因A和G的频率分别为84．0％和16．0％。贮检验表明样本具有群体代表性(躬=3．276，尸>O．05)。50例正常儿童rsll08580位点AA、AG、GG型分别为27例(54．0％)、22例(44．0％)、1例(2．0％)，等位基因A和G的频率分别为76．0％和24．O％。贮检验表明样本具有群体代表性(刀=2．124，2 徐州医学院硕士学位论文P>0．05)。rsll08580位点的三种基因型比较，差异有统计学意义纰=7．062，尸三O．029)，但等位基因之间比较，差异无统计学意义妣=2．ooO，卢1．157)。50例ADHD患儿rs2519152位点AA、AG、GG型分别为48例(96．0％)、4例(8．0％)、0例(0．0％)，等位基因G和A的频率分别为96．0％和4．0％。贮检验表明样本具有群体代表性(胪O．087，尸>0．05)。50例正常儿童rS2519152位点AA、AG、GG型分别为36例(72．O％)、ll例(22．0％)、3例(6．0％)，等位基因G和A的频率分别为83．0％和17．O％。贮检验表明样本具有群体代表性(躬=2．429，尸>0．05)。ADHD患儿与正常儿童rs2519152位点的三种基因型比较差异有统计学意义倪2-7．486，卢0．024)，等位基因之间比较差异也有统计学意义倪2_8．992，仁O．003)。结论1、DpH基因rsl611115位点AD皿组与正常对照组基因型和等位基因频率分布无差异，CC基因型最常见。rSl611115位点多态性可能不是苏北地区汉族人群AD皿的易感基因位点，可能与AD皿不存在关联。2、DDH基因rSll08580突变位点AD皿组与正常对照组基因型分布有差异，AA型或GG型可能为ADHD的风险基因型，rsll08580位点多态性可能是苏北地区汉族人群ADHD的易感基因位点之一，可能导致AD皿。3、DBH基因璐2519152位点多态性与中国苏北地区汉族人群ADHD的发生相关，其基因型AA可能是ADHD的风险基因型，等位基因A可能是风险等位基因，该位点可能是AD皿的易感基因位点之一，可能与AD皿的发病存在关联。关键词儿童注意力缺陷多动障碍；多巴胺p羟化酶；基因多态性 徐州医学院硕士学位论文StudyonTheCorrelationbetweenGen01typicandHaplotypicoftheDopamineHydroxylofEnzymeandAttention—DeficitHyperactil订tyDisorderAbstractObjec蜥ecT0inVeStigateme弱sociationofdop锄inephydroxyl懿epolymo印Ksms、杭nlA旅Intion-deficithype删砸vitydisomer(ADHD)i11aChilleseHaIlpo叫ationbysCre咖ng龇ge鹋DpHofrsl611115(-1021C∞，rsll08580(444G／A)alldrs2519152㈣)site，iIlordert0reVe甜tlleroleofthegeneDBHinADHDetiologymechallism．Methods50cllildr钮、7l，itllADHDaIld50Ilolmalchildren、Ⅳereenrolled．黜1611115，rsll08580锄drs2519152siIl舀enucleotidepolymorl蛳sms(SNP)waSex觚li鹏d丽tllPCR锄dRFLPtechniques．m娜e枷、，i够ofDpHw弱detennined谢t量lEUSA．Results111e骶quenciesofmersrSl611115CC，CT，TTgenotypesintlleADHDgroupwere74．O％，22．0％，4．0％陀spectiVely，allele伍，1uencieswere85．0％forrS16115C趾d15．O％forT．m舭quenciesof恤rsl611115CC，CT"1vrgenot)rpesinmecon俩lg舢pwere78．O％，20．0％，2．0％reSpectiVely，allele6即encies、Ⅳere88．O％forrsl611115C觚d12．0％forT．AllofthesaInpleshad跏r印rese删iontIll-oughH锄匆-W．eiIjbe玛bal锄ceanalysis．111e舶qucnciesdidIl’tshowsi鲥ficantdi能rencesbe咖thecon仃DlgroupandADHD印up口=0．805forgenotypes觚dP=0．535forallele)．m丘equenciesof’也ers鹉1108580AA，AqGGgenot)，pesin龇AD皿groupwere74．O％，20．O％，6．O％respectively，“lelef诧quencieswere84．0％forrsll08580AaIld16．O％fOrGm毹quenciesofmcrSrsll08580AA，AGGGgenotypesin恤con仰l鲫Iupw讹54．O％，44．0％，2．0％respectiVely，allele舶quencieswere76．0％forrsl611115Aand24．O％forGAllofthesanlpleshad母’ouprepresentationthrou曲H龇dy—Wcinbe玛bal黜eaIlalysis．111e能quenciesofgenot)rpesshowedsigIlific觚tdi脓cncesb咖een舭coIl仃01group锄dADHDgroup(P=O．029)，but船舶quencies4 徐州医学院硕士学位论文ofalleledidIl’tshowsi鲥fic锄tdi脑．enCes(P=O．535)．m舭quenCiesof龇rs2519152AA，A13IGGgen0锣pesiIl恤AD皿groupwere96．0％，8．0％，0．O％reSpectively，allele舶quencieswere96．O％forrs2519152Aand4．O％forG．低舭删iesofmcrS2519152AA，AGGGg锄t)，：pcsiIl“con的lgroupwere72．O％，22．0％，6．0％respe曲Vcly"allele缸quencieswe∞83．0％矗竹砣519152Aand17．慨forGA11ofmes唧leshad踟representation娜H棚y-Weinbe唱balanceaIlalysis．，nle舶quenciessho、砌si嘶fic趾tdi舵rencesbe觚eent11econ缸Dlgrollp锄dADHDgr01叩("P=0．024forgen0锣pes锄dP=o．003矗)rallele)．ConcIusi蛐1．ResunSshowedmatmerSl611115mll切ntisprescntinpatients晰mADHDinnomlemji哪p池e．but吐lersl611115m1嘲呲maynotbe勰socia斓wi廿lADHD．2．Res．ultsshowed慨龀rsll08580mu切ntisp舱sentiIlpati锄：ts、7l，iⅡlAD皿inn0慨ji锄gSup∞vme．nereisnoe位Ctwhen璐1108580siteeXistalone，wmleitisillⅡlehomoz)，gousstateit晰UhaVearel撕onshipwimADHD．3．，nlers2519152m删isprcsemillpatientswimADHD血n(IItllemJiangSupr0V硫e．andmers2519152m删may懿sociaced、)l，i廿lADHD5 徐州医学院硕士学位论文缩略词ADHDAGEbpDAdNTPDNADpHEBEPNE缩略词表Abbreviation英文全称中文全称Attention-deficithyperactiv时disorder注意力缺陷多动障碍Agarosegelelec仰poresisbasepairDopaIIlinedeoxybonucleotidetriphosphateDeox)，ribonucleicaCidD0paⅡlillep—hy出0XylaseEtllidiumbrommideEppendorfNorepinepMne琼脂糖凝胶碱基对多巴胺脱氧三磷酸腺苷脱氧核糖核酸多巴胺p羟化酶溴化乙锭离心管去甲肾上腺素PCR-RFLPPolyIIleraSeCh血Reaction-Re嘶ction聚合酶链反应嘏制性F捌gnlentLengmPol肿orpllismTBETris．Boricacid．EDTAIpmSNPrevolutionpermimlteSingleNucleotideP01ymo印11isms酶切长度多态性三羟甲基氨基甲烷．硼酸．乙二胺四乙酸每分钟转速单核苷酸多态性 稔州医学院硕士学位论文亡鲁士丽舌儿童注意力缺陷多动障碍(觚emion-deficithypemctiv匆diso玎der，ADHD)又称小儿多动症，是儿童期和青少年期常见的一种神经行为紊乱。该病以持续性的冲动、注意力无法集中及过度活动力为特征。可引起患儿学习成绩下降、伙伴关系差、亲子关系差、意外伤害风险及增加物质滥用风险。据保守估计，ADHD全球患病率约为5．29％【11。在我国ADHD患病率占学龄儿童的4．31．5．83％，如不及时有效治疗，其中70％左右患者将会持续到青春期，部分患儿可持续到成人，并且有可能发展为违法犯罪、物质滥用或反社会人格等【2l。目前，儿童多动症的病生理机制尚不清。多数研究者普遍认为该病为一种高度遗传疾病，主要涉及多巴胺(dop跚liIle，DA)、5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素系统㈣弧潮lrine，NE)等【3】。神经心理学与成像学研究显示：ADHD与额前皮质的改变及额前皮质与纹状体和小脑连接的改变相关【4】。额前皮质是调节行为、注意力及情感的关键区域。此区域对周围的神经化学环境极其敏感，过高或过低的儿茶酚胺的释放均会减弱对行为和注意力的认知控制。动物电生理学研究发现，NE通过突触后砣A肾上腺素受体能增强相似特征神经元的神经信号，而·DA能通过调节Dl受体的刺激而减弱其它神经元的“噪音信号”，提高信号／噪音比。因此，NE和DA的动态平衡是维持额前皮质区正常功能的重要因素【5】，NE／DA合成通路中涉及的酶也相应成为ADHD病因学研究的热点。多巴胺p羟化酶(DpH，dop妇hyd∞xylase)是DA向NE转化的关键酶。它来源于交感神经系统，可在血浆及脑脊液中检测到。编码DpH的基因位于染色体9q34，约23kb长，含有12个外显子。DpH基因存在多个功能性多态位点，目前报道的主要有璐1611115，rsll08580，砬519152。这些位点与AD皿相关性在不同的人群中报道不尽相同。对高加索、爱尔兰及巴西等人群的研究发现，D阻内含子5区rS2519l52限制性位点多态性与ADHD存在相关性【61；B}场d嘶等也发6 徐州医学院硕士学位论文现在印度人群中外显子2区的rsll08580多态位点与脑脊液和血浆中DpH活性相关川；此外，研究发现瑙1611115位点的多态性与血浆D阻活性强烈相关，在中国人群中，此位点的变化与注意力不集中亚型及复合亚型ADHD相关，并且受性别因素影响明显【81。尽管DpH各基因多态位点与AD皿相关性研究较多，但目前尚无一致的结果。研究也发现，血浆中DpH活性差异并不能仅由一个位点解释吲。在非洲裔美国人，血浆DpH活性差异最多28．7％的可由位点rsl61115解释。此外，这些多态位点中部分还存在连锁不平衡现象。因此，如一次研究仅针对一个DBH多态位点，不从多个位点的单倍体型考虑，研究结果可能会偏离真实。最新研究结果显示，尽管DpH-STR、rSll08580、璐2519152单个位点多态性与血浆DDH活性没有相关性，但单倍体型T-A-A(rSl611115，rsll08580，rs2519152)与血浆DBH活性呈明显相关【10】a因此，综合DpH多个多态性位点的单倍体型与ADHD进行相关性分析对揭示DpH在ADHD病因学机制中的作用有重要意义。本实验拟利用DpH基因的单核苷酸多态性，在苏北地区汉族人群中对rsl611115，rsll08580，rs2519152三个位点进行单倍体型分析，阐明这三个位点基因多态性在中国北方地区汉族人群中的分布规律，从而揭示其与ADHD发病之间的关系。本实验的创新之处在于能够有效地将基础性研究的成果，直接应用到临床，并为基因诊断、早期发现及防治及合理用药提供指导和理论依据。7 徐州医学院硕士学位论文材料和方法1材料1．1试剂研叮A提取试剂盒上海赛百盛基因技术有限公司DNA纯化试剂盒nANGEN引物英潍捷基(上海)贸易有限公司烈’TP、蛐、呦酶、№北京全式金生物技术有限公司内切酶NEB琼脂糖GENETECH嘶s、硼酸、EDTASuI】shine人多巴胺B．羟化酶酶联免疫检测试剂盒R．&D1．2试剂配制1．2．15×TBE配制Tris54．Og硼酸27．59EDl’A0．5mol／L20ml(PH=8．O)蒸馏水加水至1000IIll1．2．24．O％琼脂糖凝胶(AgarosegelelecnDphoresis，AC迅)配制取2．Og琼脂糖加入50ml电泳缓冲液(0．5×TBE)，高火加热至沸腾后小火保持沸腾10分钟，冷却至80℃以下，加入10山溴化乙锭(e廿lidiumbfoIIlide，EB10删，摇匀后冷却至60℃左右，倒入胶模中，插入梳子，室温下避光放置一小时，待其彻底凝固后，4℃保存待用。1．3仪器8 徐州医学院硕士学位论文QL-866型漩涡混合器5804R型低温高速离心机LX．200型掌式离心机ELl04型电子分析天平PS300．B型电泳仪’PCR仪ZF．A型紫外投射反射分析仪微量移液器GZX．9140MBE型数显鼓风干燥箱协10n-1600RGelImageSyStem唧-42型快速恒温数显水箱超纯水系统立式压力蒸汽灭菌器2方法2．1一般资料2．1．1ADHD组海门市麒麟医用仪器厂德国Eppendorf公司海门市麒麟医用仪器厂M砌ertolodoHoeferAppliedBiosyStems2720上海骥辉科学分析仪器有限公司德国唧忧Indod公司上海博迅实业有限公司医疗设备厂上海天能科技有限公司常州国华电器有限公司IIlillipore上海博迅实业有限公司医疗设备厂选择2010年11月~2011年4月在徐州市第一人民医院就诊初诊的AD皿患儿入ADHD组。纳入标准：年龄为5．18周岁之间，按照SNAP．Ⅳ制定的诊断标准，由一名以上儿科主任医师确诊：苏北地区出生，无长期外地居住史，中国汉族人；瑞文智力测试智商大于70。排除标准：身体残疾、心里创伤、综合性精神发育障碍及智力发育迟缓；近两周有急、慢性躯体感染史；早产儿或出生时伴有脑损伤者；不伴有其他发生于儿童期的精神障碍(如重度秽语综合征等)。记录入选患者的基线信息(性别、年龄、智商等)，签署知情同意书。2．1．2对照组选择同期在徐州市第一人民医院儿科康复部的健康体检儿童。纳入标准：年龄为5．18周岁之间，瑞文智力测试智商大于70：无家族类似疾病史。9 徐州医学院硕士学位论文2．2血样的处理与DBH酶活性检测2．2．1血样的收集在研究对象知情同意的前提下，采集其外周血5“，EDTA-Na2抗凝，5000rpm离心5mill，取上层血浆于干净的新EP管中，．80℃冻存，下次血样置于．200C低温保存待用。．‘2．2．2血液中基因组DNA的提取采用树脂型踟基因组DNA提纯试剂盒提取。基本原理，在高盐状态下，DNA纯化树脂专一性地吸附DNA；而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。此法快速简便，安全性高(无需、氯仿等有机试剂)，提取的DNA较纯。操作步骤(见上海赛百盛基因技术有限公司DNA提取试剂盒提供的方法)①将下层血样轻轻混匀，转移O．5llll下层血样到1ml纯化树脂中(使用前充分混匀)，颠倒混匀5．6次。室温下温育3分钟，其间颠倒混匀一次，5000印m离心3秒，收集沉淀。②用1mlGN结合液将纯化树脂悬浮，颠倒混匀，5000岬离心3秒，收集沉淀。③用0．5ml漂洗液漂洗纯化树脂两次，颠倒混匀，5000印m离心3秒，收集沉淀。如果纯化树脂仍然呈现黄色或褐色，重复第3步一次。④用O．8“无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱，12000r1)m离心1分钟，倒掉废液收集管中的乙醇，再离心1分钟，并室温静置15分钟尽量除尽乙醇。⑤将纯化柱套入一个干静的1．5“或2ml离心管中，加入100¨lTE缓冲液或无菌超纯水于纯化树脂上(不能粘在管壁上)，室温下放置3分钟，12000q)m离心2分钟。为获得较大量基因组DNA，重复第5步l~2次，这样可以获得高产量的基因组DNA。⑥离心管中收集的液体即是洗脱下来的基因组D1呵A，取2“l电泳(2％琼脂糖，120v，20分钟)检测。2．2．3血浆DpH活性检测(试剂盒由美国R&D公司提供) 徐州医学院硕士学位论文采用的是双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中人多巴胺p．羟化酶(p．DH)的水平。基本原理：向预先包被了人多巴胺B．羟化酶(p．DH)单克隆抗体的酶标孔中加入多巴胺B．羟化酶(p-DH)，温育；洗涤后，加入Ⅷ姆标记过的多巴胺B．羟化酶(B-DH)抗体。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中人多巴胺B．羟化酶(DDH)的浓度呈正相关。具体操作步骤如下：①标准品的稀释：将标准品分别稀释为15U，L、30U，L、60U／L、120U，L、240帆五个标准浓度②分别设空白孔、、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入稀释好的标准品50肛l：在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40山，然后再加待测样品10山，37℃温育30分钟。③弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。④每孔加入酶标试剂50山，空白孔除外。混匀，37℃温育30分钟。⑤弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。⑥每孔先加入显色剂A50m，再加入显色剂B50m，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟．⑦取出酶标板，每孔加终止液50斗l，终止反应。⑧测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。⑨根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。特别注意由于样品为稀释过后的，其实际浓度应该乘以总稀释倍数，即应×5。2．3PCR及酶切2．3．1引物设计本课题所用引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成(见表1) 徐州医学院硕士学位论文2．3．2rsl611115基因多态性检测PCR：反应体系为30pl，含DNA模板4．0山，上下游引物O．5pl(10岬。儿)，dNTP1．o肛l(10nunol／L)，T两酶o．5斗l(5u／¨1)，lo×bu丘-er2．o放含Mgcl2)，H2021．5m。循环参数：950C预变性3miIl；940C变性30s；650C复性30s；720C延伸30s，共35个循环：最后720C延伸10min。PCR产物经2．0％琼脂糖凝胶电泳检测得到目的片段后进行酶切鉴别其基因型。酶切：PCR扩增产物用限制性内切酶胁I进行酶切，酶切反应体系为：胁I限制性内切酶0．5山(10U／m)，10×NEBbu侬Ir42．Om，BASO．2pl，PCR产物10pl，H207．3山，混匀后置37。C消化4小时。随后，抽取5．0山酶切产物，与6×上样缓冲液1．0m混合均匀后，用4．O％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色，以DNAMaker为分子量标准，120V电压电泳20分钟，至于紫外灯下，经系统成像拍照。rsl611115基因PCR产物的纯化(试剂盒由TIANGEN提供)，具体操作步骤如下：①向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500山的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。②根据PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。③将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，温室放 徐州医学院硕士学位论文置2分钟，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。④向吸附柱CB2中加入600肛l漂洗液PW后静置3分钟，12000靶离心30s，掉到收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。⑤向吸附柱CB2中加入600m漂洗液PW，12000呻离心30s，掉到收集管中的废液。⑥将吸附柱CB2放入收集管中，1200011)m离心2分钟，尽量出去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。⑦将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30一50m去离子水作为洗脱液，室温放置2分钟。12000印m离心2分钟收集DNA溶液。为了提高DNA的回收量，将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤⑦。测序：在100例样本中随机选取CC型、CT型、TT型标本各一例，将PCR扩增产物进行纯化后，送于生工生物工程(上海)有限公司测序，以验证PCR-RFLP分型结果。2．3．3rsll08580基因多态性检测PCR：反应体系为40山，含DNA模板4．0山，上下游引物1．O山(10岬o㈣，dNTP1．0m(10IllrIlo儿)，嘲酶0．5“l(5U／山)，bu虢r2．0山(含MgCl2)，H2030．5肛l。循环参数：950C预变性7IIlin；950C变性30s；630C复性30s；72。C延伸45s，共35个循环：最后720C延伸5min。PCR产物经2．0％琼脂糖凝胶电泳检测得到目的片段后进行酶切鉴别其基因型。酶切：PCR扩增产物用限制性内切酶EcoNI进行酶切，酶切反应体系为：ECoNI限制性内切酶O．5m(10Um)，10×NEBb曦r42．Om，PCR产物10m，H207．5山，混匀后置37。C消化4小时。随后，抽取5．0m酶切产物，与6×上样缓冲液1．0m混合均匀后，用4．0％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色，以DNAMal【er为分子量标准，120V电压电泳20分钟，至于紫外灯下，经系统成像拍照。 徐州医学院硕士学位论文rSll08580基因PCR产物的纯化(试剂盒由TIAN研N提供)，具体操作步骤同2．3．2。测序：在100例样本中随机选取AA型、AG型、GG型标本各一例，将PcR扩增产物进行纯化后，送于生工生物工程(上海)有限公司测序，以验证PCR-I心LP分型结果。2．3：4rs2519152基因多态性检测PCR：反应体系为40山，含DNA模板4．0山，上下游引物1．0山(10呻[10儿)，dNTP1．Om(10n瑚ol／L)，啊酶0．5pl(5U／山)，b临2．0斗l(含MgCl2)，H2030．5pl。循环参数：950C预变性5min；940C变性60s；560C复性60s；720C延伸90s，共35个循环：最后720C延伸5min。PCR产物经2．0％琼脂糖凝胶电泳检测得到目的片段(如图7所示)后进行酶切鉴别其基因型。酶切：PCR扩增产物用限制性内切酶啪I进行酶切，酶切反应体系为：嘲I限制性内切酶0．5山(10U／肛1)，10×NEBb删2．0pl，BSA0．2“l，PCR产物10山，H207．3pl，混匀后置65。C消化4小时。随后，抽取5．0pl酶切产物，4母啄上样缓冲液1．0m混合均匀后，用4．O％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色，以DNAMal【er为分子量标准，120V电压电泳20分钟，至于紫外灯下，经系统成像拍照。rS2519152基因PCR产物的纯化(试剂盒由TIANGEN提供)，具体操作步骤同2．3．2。DNA测序：在100例样本中随机选取AA型、AG型、GG型标本各一例，将PCR扩增产物进行纯化后，送于生工生物工程(上海)有限公司测序，以验证PCR-RFLP分型结果。2．4统计分析方法应用基因计数法计算基因型频率和等位基因频率，基因频率和等位基因频率采用同组中构成比比较的，检验。患者与Hardy．wreiI她rg(H．w)平衡的符合程度采用，检验；计量资料数据采用Ine锄士sD；临床变量的两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。基因型与AD皿的相关性采用Logistic回归分14 徐州医学院硕士学位论文析，相关危险因素评价用比值比(OR)分析。应用sPSSl6．O软件处理数据，尸<0．05为有显著性差异。 徐州医学院硕士学位论文结果1、一般临床资料纳入研究的ADHD组患儿共50例，男40例(80％)，女lO例(20％)，年龄5．13岁，平均8．40(8．40±0．25)岁，均为汉族，平均智商109．04(109．04±1．80)。对照组共50例，男31例(62％)，女19例(38％)，年龄5．14岁，平均8．12(8．12±0．31)岁，均为汉族，平均智商111．48(111．48±1．74)。两组在年龄、智商构成上无统计学差异(年龄：P=O．103；智商：仁0．551)。2DpH活性测定ADHD组为105．79±93．80U／L；对照组为70．57±57．03U／L，经f检验，两组DBH有统计学差异(，=2．249，P-=O．027)，ADHD组显著高于对照组。3DpH基因瑙16n115位点多态性分析3．1rSl611115基因多态性筛查结果PCR产物经2．O％琼脂糖凝胶电泳检测得到目的片段，如图1。1234M134bp250bp100bp图1叩H基因rSl611115位点PCR电泳结果基因型的判定：根据引物设计，rSl611115基因PCR产物大小应分别为134bp。rsl611115位点C—T后不能被HhaI酶识别，因此不能被酶切。野生纯合型(CC)没有mlaI酶切位点，消化产物产生一个片段，长度为109bp，杂合变异性(CT)产生三个片段，长度为134bp，109bp和25bp，由于25bp较小，因此只能显示出134bp和109bp两个条带，而纯合型(TT)不能被酶切，只有一个134bp片段，检测结果如图2所示。16 徐州医学院硕士学位论文1234567M134bp111bpM：Marker；1、3、4、6、7为CC型；5为CT型；2为TT型图2DpH基因rsl611115位点PCR—RFLP电泳结果150bp100bp测序结果如图3所示。!t、6C了GCC了e，、6下C了nC了罩6e6CG胁G，。GG，，C，，GGnG6G；，。6图3一aDpH基因rsl611115位点CC型五GC’rGCC丁C^GTCTACT6CGCG^G^66ACAGG文GGG^G图3-bD刚基因rsl611115位点CT型17 徐州医学院硕士学位论文图3一cDpH基因rsl611115位点TT型3．2两组人群等位基因和基因型分布频率研究发现，50例ADHD患儿中rsl611115cC型、CT型、1vr型分别为37例、11例、2例，基因型频率分别为74．0觞、22．O脱、4．0慌，等位基因频率为C：85．0％，T：15％，50例对照组儿童中11s1611115CC、CT、TT型例数分别为39、10、1，频率分别为78．O％、20．O％、2．O％，等位基因频率为：A：88．O％，C：12．0％，见表2表示。表2rSl611115基因型和等位基因分布频率(n-50，％)3．3两组人群Ha∞dy-weinbe喀遗传平衡法则的吻合度检测为了解两组研究人群是否为遗传平衡群体，用躬检验法分别对ADHD组和对照组rSl611115位点各基因型分布进行Hardy-weinbe唱遗传平衡吻合度检测，结果见表3。表3患者的rsl611115基因型观察值和期望值(n_50)CCCTTT组别——妇P值期望值观察值期望值观察值期望值观察值ADHD组36．133712．75111．1320．940．33 徐州医学院硕士学位论文对照组38．7239lO．56lO0．7210．14O．713．3两组人群等位基因和基因型分布频率比较ADHD组与对照组rsl611115位点多态性基因型分布比较，差异无统计学意义(俨0．434，脚．805)；等位基因频率比较，差异亦无统计学意义(船=O．385，卢0．535)，提示单个rSl611115位点可能与AD皿疾病无关，结果如表4。表4rsl611115多态性在ADHD组和对照组中的分布比较(n，％)4DpH基因rsll08580位点多态性分析4．1rSll08580基因多态性筛查结果pCR产物经2．O％琼脂糖凝胶电泳检测得到目的片段(如图4所示)。M1234567207bp图4DpH基因rSll08580位点PCR电泳结果基因型的判定：根据引物设计，PCR产物大小应为201bp。rsll08580位点A_G后可以被EcoNI限制性内切酶识别，因此酶切反应后野生纯合型(AA)未被酶切，只产生一个片段，大小为201bp，杂合变异性(AG)产生三个消化片段，大小分别为20lbp、163bp、38bp三个片段，而纯合型(GG)经消化后，产生两个消化片段，大小分别为163bp和38bp。由于38bp较小，仅有一个等位基因突变时，显色较浅，杂合变异性(AG)因此只能显示出209bp和168bp两个条带，检测结果19 徐州医学院硕士学位论文————二—————二——————————————————————————————————————————一如图5所示。寻2否睇38bpM：Marker：1、2、3、5、7为AA型；4为AG型；6为GG型图5DDH基因rsl108580位点PCR—RFLP电泳结果测序结果如图6所示。图6一aDBH基因rsl108580位点从型图6_bDpH基因rsl108580位点AG型20 徐州医学院硕士学位论文CAA6GATTACC．rCAtGA6t童A6G6GT舀GC6CG矗B图6一cD刚基因rsll085∞位点∞型4．2两组人群等位基因和基因型分布频率研究发现，50例ADHD患儿中rSll08580从型、AG型、GG型分别为37例、10例、3例，基因型频率分别为74．o／％、20．0糯、6．o／％，等位基因频率为A：84．0％，G：16％，50例对照组儿童中rsll08580AA、AG、GG型例数分别为27、22、1，频率分别为54．0％、44．O％、2．0％，等位基因频率为：A：76．O％，C：24．0％。如表5表示。表5rSll08580基因型和等位基因分布频率(n_50，％)4．3两组人群Hafdy．、7l，cinbe玛遗传平衡法则的吻合度检测为了解两组研究人群是否为遗传平衡群体，用矿检验法分别对AD皿组和对照组rsll08580位点各基因型分布进行呐-we姗遗传平衡吻合度检测，结果如下表6。表6患者的rsll08580基因型观察值和期望值(n．50)21 徐州医学院硕士学位论文4．4两组人群等位基因和基因型分布频率比较ADHD组与对照组rsll08580位点多态性基因型分布比较，基因型间差异有统计学意义妣=7．062，P=O．029)；等位基因间差异无统计学意义仅2=2．000，P-1．157)。AD皿患儿的基因型AG型比对照组少，而AA和GG基因型较对照组多。提示可能是此突变位点单独存在时并不起作用，只有它处于纯合状态时才与ADHD相关。如表7表7rsll08580多态性在ADHD组和对照组中的分布比较(n，％)5D口H基因rs2519152位点多态性分析5．1rs2519152基因多态性筛查结果PCR产物经2．O％琼脂糖凝胶电泳检测得到目的片段(如图7所示)后进行酶切鉴别其基因型。M1234567500bp400bp图7DpH基因rs2519152位点PCR电泳结果464bp基因型的判定：根据引物设计，PCR产物大小应为464bp。TaqI(A_G)位点突变前可被TaqI限制性内切酶识别，突变后此酶切位点不能被酶切，因此酶切 反应后野生纯合型(AA)被酶切，产生两个个片段，大小分别为300bp和164bp，杂合变异性(AG)产生三个消化片段，大小分别为464bp、300bp、164bp三个片段，而纯合型(GG)经消化后，仅产生一个消化片段，大小为464bp，检测结果如图8所示。M1234567M：Marker：2、4、5、6、8为M型；1为AG型；3、7为GG型图8D叫基因rs2519152位点PCR—RFLP电泳结果测序结果如图9所示。64bpoobp64bpA6GA6TGAGCrrCG氨GGTCeTGTCTGAG图9一aDpH基因rs2519152位点从型A6AGT6AGCTCG6GTCTGTCT6GAG图9_bDDH基因rs2519152位点AG型 徐州医学院硕士学位论文AGG轰瞄下6ADCTC6TCC苫G譬CCeTG§G纛S图9一cDpH基因rs2519152位点GG型。5．2两组人群等位基因和基因型分布频率研究发现，50例ADHD患儿中砬519152AA型、AG型、GG型分别为46例、4例、0例，基因型频率分别为92．o／％、8．O慌、0．0／％，等位基因频率为A：96．0％，G：4．0％，50例对照组儿童中rs2519152AA、AG、GG型例数分别为36、ll、3，频率分别为72．0％、220％、6．0％，等位基因频率为：A：83．0％，C：17．0％。如表8表示表8rs2519152基因型和等位基因分布频率(n_50，％)Tab．m缸邺iesdi删on0frsrs2519152gen0孵sandallele5．3两组人群Hardy．、veinbe唱遗传平衡法则的吻合度检测为了解两组研究人群是否为遗传平衡群体，用#检验法分别对ADHD组和对照组磁519152位点各基因型分布进行Hardy-weinbe玛遗传平衡吻合度检测，结果如下表9。表9患者的砣519152基因型观察值和期望值(n-50) 徐州医学院硕士学位论文5．4两组人群等位基因和基因型分布频率比较ADHD组与对照组rs2519152位点多态性基因型分布比较，基因型间差异有统计学意义∞=7．486，卢0．024)；等位基因间差异也有统计学意义侥2=8．992，尸==0．003)。AD皿患儿的基因型AA型比对照组少，而AG和GG基因型较对照组多。提示此位点与ADHD相关。如表10表10rs2519152多态性在创)皿组和对照组中的分布比较(n，％) 徐州医学院硕士学位论文讨论ADHD受多种因素影响，其遗传流行病学研究发现，遗传因素在该病的发病中起到重要作用。英国Cardifr大学的安妮塔·塔帕尔【11】领导的研究小组在2010年底的《柳叶刀》杂志上报告指出，他们选取1400多名儿童，进行基因组图谱扫描，结果发现患有剐阱ID的儿童，其DNA明显比正常儿童更容易出现基因突变、基因片段缺失或基因片段复制异常。因此他们认为，ADHD是一种遗传失调导致的疾病，使得AD皿患儿的大脑与其他儿童的大脑发育存在差异。额前皮质儿茶酚胺的平衡是影响儿童行为表现的重要因素，DDH是DA转化为NE的限速酶，因此DI阻基因多态性成为人们关注的焦点，虽然国内外文献大量报道了基于DpH基因多态性的研刭12‘1剐，但是真正适用于中国人群的报道却很少见。由于基因的遗传变异频率存在明显的种族、地域差异，将国外人群的研究结果完全照搬到中国人群中是不切实际的，因此，阐明中国人群中DBH基因多态性与AD肋之间的关系，对于基因诊断、早期发现及防治及合理用药具有重要的临床指导作用。1DBH活性比较分析D阻将DA氧化为NE，是NE合成的限速酶，DpH由含NE的神经元特异性表达，它是唯一一种存在于突出及囊泡内的儿茶酚胺合成酶，研究发现DBH的活性增加与寻找新的行为和冲动有关【161。本研究发现ADHD组血浆DpH活性为105．79±93．80肌，对照组为70．57±57．03U／L。两组DDH活性有统计学差异(户2．249，尸=O．027)，ADHD组显著高于对照组。结果提示血浆DBH活性的增强与ADHD的发生可能存在一定的关系。2瑚1611115位点基因多态性与AD皿的关联分析璐1611115位于DpH基因5’端，是DpH基因一个重要的点突变。Zabeti觚等‘17‘191通过对美国白人、美国黑人和日本人群的基因型和血清酶活性分析及基因序列突变检测，发现在DpH基因5’端一个重要的点突变可以解释DBH活性35％．52％的变化基因型1T型提示较低的DDH活性，杂合子提示中等酶活性。rsl611115位点也与血浆DBH活性明显相关，较多研究表明，血浆和脑脊液中DDH低活性与某 徐州医学院硕士学位论文些精神疾病症状易发有关‘捌。HessC等昭11对于德国407例成人ADHD患者研究发现瑙1611115位点突变纯合型TT基因型与成人AD皿发病相关，AD皿组CC与CT基因型少于对照组。DasM等【221对一组印度的病例进行研究，并未发现rsl611115位点多态性与ADHD存在关联，且ADHD各亚型(DSM．Ⅳ)之间等位基因也不存在差异。本课题对中国淮海地区汉族50例AD助患儿和50例正常对照者rSl611115位点基因多态性与ADHD的相关性进行了分析，研究发现基因型cc、cT、，rr和等位基因C、T频率在两组人群中的分布差异均无统计学意义(P>O．05)。以上结果表明单个位点与ADHD的发病在中国淮海地区汉族人群中可能没有相关性。也有可能因为本研究中ADHD组与对照组的样本量较少，并为发现此位点与ADHD相关性，但此研究结果并不能排除此位点与ADHD的关系，增加样本量再次研究探讨是必要的。3．瑙110580位点基因多态性与AD肋的关联分析DpH基因第2外显子上的rsll08580位点多态性与血浆及脑脊液中的DpH水平相关‘蚓，Bhaduri等嘲发现此多态性在印度人群与ADHD相关。对中国人群的研究发现，此位点的变化与注意力不集中亚型及复合亚型ADHD相关，并且受性别因素影响明显【241。H瘌Z等f251对于一组爱尔兰AD皿患者的研究发现，与对照组相比ADHD组A等位基因突变率较高，但无统计学意义(P=o．34)，但当rsll08580位点发生突变同时rS2519152位点不突变时，则ADHD组与对照组有明显差异(P=o．045)，提示此疾病可能是多位点共同作用的结果。KDpeckovaM等【2q在捷克人群中的研究发现，A等位基因频率升高，ADHD的患病风险也相应增加。D嬲M掣221在印度人群中的研究却发现该位点与ADHD的发病无相关性。本课题分析了中国淮海地区汉族50例ADHD忠儿和50例正常对照者rsll0580位点基因多态性与ADHD的相关性，研究发现两组rsll08580位点基因型AA、AG、GG间差异有统计学意义(P量0．029)：等位基因A、G间差异无统计学意义(p1．157)。ADHD患几的基因型AG型比对照组少，而从和GG基因型较对照组多。提示可能是此突变位点单独存在时并不起作用，只有它处于纯合状态时才与ADHD相关。 徐州医学院硕士学位论文4．璐2519l鸵位点基因多态性与AD助的关联分析在高加索、爱尔兰及巴西等人群的研究【271发现，DpH内含子5区1姻I限制性位点即rs2519152位点多态性与ADHD存在相关性。DaJyl2剐等经基于单体型的单体型相对危险度(HHRR)研究发现rs2519152位点等位基因A优先传递给患儿p